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液相色譜儀的正確使用與維護(hù)

更新時(shí)間:2019-11-23      點(diǎn)擊次數(shù):3451
  液相色譜儀(HPLC)是分析實(shí)驗(yàn)室常用的測試儀器之一,其應(yīng)用越來越廣泛。此種儀器在使用過程中,難免會出現(xiàn)各種各樣的問題,并將直接影響到所測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和儀器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因,即可清楚預(yù)防和排除這些故障的方法,就可正確地使用儀器并大限度地發(fā)揮儀器的性能。今天我們要從以下幾個(gè)方面和您分享下在使用液相色譜儀中需注意的幾個(gè)問題。
 
  一、使用試管的問題
 
  1、試管的潔凈問題。液相色譜分析法是一個(gè)很靈敏的分析方法,如果因使用不潔凈的試管,便會影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如,在用甲醇作溶劑來溶解樣品時(shí),所用的小試管是用橡膠塞來做蓋子的,因此,在每次進(jìn)樣時(shí),都有一個(gè)保留時(shí)間固定的干擾峰存在,后經(jīng)證實(shí),此干擾峰是由甲醇浸泡橡膠塞而溶下的組分所產(chǎn)生,換用玻璃試管后,干擾峰消除。
 
  2、塑料試管的溶解問題。近年來,一次性塑料試管給試驗(yàn)人員帶來了極大的方便,但是,在使用過程中一定要注意有機(jī)溶劑對試管的溶解現(xiàn)象,在利用此種試管提取樣品時(shí),有些有機(jī)溶劑對管壁有溶解現(xiàn)象,這些被溶解下來的物質(zhì)有時(shí)也能在檢測器上產(chǎn)生信號,從而干擾樣品的測定。這時(shí),可用相同的實(shí)驗(yàn)條件先行試驗(yàn)一下,看看不含被抽提物時(shí),提取液在檢測器上能否產(chǎn)生干擾信號,如確有干擾信號存在,就只能換用耐有機(jī)溶劑的玻璃試管了。
 
  3、被測樣品在試管壁上的吸附問題。這個(gè)問題也應(yīng)引起注意,否則也會影響測試結(jié)果的準(zhǔn)確性,在治療藥物監(jiān)測(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中,有些被測藥物如阿米替林,丙咪嗪等易吸附在玻璃試管的管壁上,因此,操作中宜采用聚丙烯管,為防止提取中吸附現(xiàn)象的發(fā)生,可采用0.5%的已二胺已烷液做為提取劑,可有效地防止吸附。
 
  二、操作進(jìn)樣閥的問題
 
  目前,在分析型液相色譜儀中常用的進(jìn)樣閥是7725型進(jìn)樣閥,其內(nèi)部的六通閥結(jié)構(gòu)使進(jìn)樣操作非常方便,但是,如果使用不當(dāng),也會帶來問題。例如,在液相色譜法的試驗(yàn)過程中,有時(shí)會有異常色譜峰的出現(xiàn)以及重現(xiàn)性不好的問題,這主要是由于操作方法不當(dāng)所引起,要想解決此類問題,需從以下幾個(gè)方面入手。
 
  1、進(jìn)樣量的控制。用進(jìn)樣閥來進(jìn)樣時(shí),閥內(nèi)的樣品環(huán)是定量的,(一般分析型進(jìn)樣閥的樣品環(huán)體積為20ul),由于進(jìn)樣時(shí),注射到進(jìn)樣閥內(nèi)的樣品溶液在樣品環(huán)的管路中有徑向的速度梯度(即管軸處比管壁處的液流速度快)。因此,要想使樣品環(huán)中充滿樣品溶液,從而使用進(jìn)樣閥來準(zhǔn)確地定量,則必須使進(jìn)樣量大于樣品環(huán)體積的2倍。如果用注射器來控制進(jìn)樣量,則大只能注射樣品環(huán)體積1/2的量,這樣才能防止部分樣品由溢流管溢出從而導(dǎo)致定量分析的誤差。
 
  2、進(jìn)樣閥的清潔問題。如果樣品環(huán)中有上次進(jìn)樣時(shí)樣品的殘留,必然會污染下次注射進(jìn)的樣品,為防止這種現(xiàn)象的發(fā)生,應(yīng)按下列步驟操作:a.進(jìn)樣閥有2個(gè)位置,INJECT和LOAD。首先在LOAD位置時(shí),以注射器將流動相注入進(jìn)樣閥內(nèi)清洗幾次,每次用量大約40ul;b.然后將進(jìn)樣閥板手扳至INJECT位置時(shí),再以流動相清洗幾次,每次用量還是40ul;c.后,再將樣品注射到進(jìn)樣閥里。
 
  按照上述的步驟操作,可以避免由進(jìn)樣閥引起的污染,從而使干擾峰消除并提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
 
  3、進(jìn)樣閥溢流管的堵塞。有時(shí),進(jìn)樣閥的溢流管會發(fā)生堵塞現(xiàn)象,向進(jìn)樣閥內(nèi)注射樣品時(shí),注射針推不動。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解樣品的流動相用的是鹽溶液,而其中的鹽在溢流管的排空端口處結(jié)晶所致。此時(shí),可用小燒杯盛少量蒸餾水對溢流管口稍加浸泡,端口處鹽的結(jié)晶就能被溶解掉,故障排除。如能在每次進(jìn)樣完成之后,用蒸餾水反復(fù)沖洗至溢流管中的鹽分全部沖出,則可避免此故障的發(fā)生。
 
  三、流動相(MOBLLE PHASE)的問題
 
  甲醇和乙腈在液相色譜分析法中常常被用來配制流動相。液相色譜法中常用的試劑好是高等級的試劑,如色譜純試劑。在要求不太嚴(yán)格時(shí),優(yōu)級純甚至分析純的試劑也能用。液相色譜分析法中常用的是紫外檢測器,因此,從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來考慮,應(yīng)該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純試劑。
 
  1、流動相的過濾。配制好的流動相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來過濾。這是因?yàn)槿芤褐泻泻芏嗳庋垭y以發(fā)現(xiàn)的微小顆粒,如果不把它們?yōu)V除掉,就會堵塞泵口、柱頭上的過濾器,這樣就堵塞了流動相的正常通道,使色譜柱的阻力增加,柱壓升高,柱效下降。碰到這種情況時(shí),要換用經(jīng)過濾的流動相,并將堵塞的濾器拆下來浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機(jī)清洗20分鐘,以除去濾片上的堵塞物。
 
  2、流動相的脫氣。流動相在使用前必須脫氣,以盡可能的除去溶解在流動相中的氣體,否則,這些氣體會使柱填料的性能降低,還能夠?qū)z測器的信號產(chǎn)生很大的干擾。脫氣有多種方法,如超聲脫氣、真空脫氣、氮?dú)饷摎獾?。真空脫氣法和氮?dú)饬髅摎夥ㄊ悄壳俺S玫拿摎夥?。水和甲醇混合后會產(chǎn)生大量的氣泡,如果不脫氣就使用,氣泡就會進(jìn)入色譜柱和檢測器,并將影響分析工作的正常進(jìn)行。
 
  四、色譜柱的使用和保養(yǎng)
 
  色譜柱是液相色譜儀主要的部件,被測物質(zhì)能否被很好的分離和測定,色譜柱的性能起著決定性的作用。因此,在日常工作中,應(yīng)特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng),以延長色譜柱的使用壽命。
 
  1、使用預(yù)柱和保護(hù)柱。預(yù)柱(pre-column)安裝于泵和進(jìn)樣器之間,它給色譜柱中的流動相提供了*的平衡,并防止了對柱填料有破壞作用的組分或污染物進(jìn)入色譜柱。保護(hù)柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進(jìn)入色譜柱,保護(hù)柱應(yīng)與色譜柱的填料相同。預(yù)柱和保護(hù)柱可以經(jīng)常更換,而不需要經(jīng)常更換色譜柱,這就延長了色譜柱的使用壽命。
 
  2、防止氣體進(jìn)入色譜柱。有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進(jìn)入的,否則將會使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室。因此,為了防止氣泡進(jìn)入色譜柱,一定要使用經(jīng)過脫氣的流動相,并且要嚴(yán)格按照下列步驟來安裝色譜柱。a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲,觀察是否有溶劑滲出;b.如有溶劑滲出,即可將色譜柱接到管路上,以避免氣泡的進(jìn)入;c.如無溶劑滲出時(shí),表明色譜柱的此端已經(jīng)進(jìn)去空氣了,此時(shí),可將色譜柱的出口端接到進(jìn)樣閥上,以流動相來反方向沖洗色譜柱,以便將柱內(nèi)的空氣排除。好以0.2ml/min的小流量來沖色譜柱,如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會導(dǎo)致柱性能的降低;d.如果流出的溶劑里不含有氣泡,說明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了,再將色譜柱以正確的方向接好,這樣氣泡就進(jìn)不到色譜柱里面了。
 
  3、色譜柱的清洗。為了不使被測物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中,在每次的樣品分析工作完成之后,都應(yīng)及時(shí)地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強(qiáng)的溶劑來洗脫色譜柱,以分析工作中常用的反相色譜分析法為例,因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì),此時(shí)應(yīng)用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來,洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動相是緩沖溶液,則應(yīng)先用蒸餾水來沖洗色譜柱,以沖掉柱內(nèi)的鹽,然后再用合適的溶劑來沖洗。
 
  凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動相,用完之后當(dāng)然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續(xù)操作,可以將緩沖溶液置于柱內(nèi)過夜,但好是維持小流速(<0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出,如果流動相中含有鹵化物,即使是停一夜,也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈,以防止它們對柱體的腐蝕。
 
  4、色譜柱的存放。如果色譜柱暫時(shí)不用,存放時(shí)要注意以下幾點(diǎn):
 
  a.幾天之內(nèi)的短期放置,應(yīng)先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來沖洗),再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。
 
  b.如果色譜柱長期不用,僅用上述方法來處理就不行了,這時(shí)應(yīng)使用色譜柱使用說明書中所指明的溶劑來充滿色譜柱,反相柱一般使用甲醇,正相柱則可用正已烷或庚烷,而凝膠柱則不能用水了,因柱內(nèi)如果有微生物的生長則會使柱效降低,此時(shí)應(yīng)用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來沖洗色譜柱,再將色譜柱封嚴(yán)。色譜柱長期放置時(shí),一定要將色譜柱的兩端封嚴(yán),以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現(xiàn)象,因這可導(dǎo)致柱效的嚴(yán)重降低。
 
  c.色譜柱應(yīng)貯存在室溫下,如果放置于0℃以下的環(huán)境里,柱內(nèi)就會結(jié)冰,這也將導(dǎo)致柱效的降低。
 
  五、色譜峰的雙峰問題
 
  長期使用后的色譜柱,如果有雜質(zhì)進(jìn)入,就會使色譜柱入口處的固定相“板結(jié)”并在流動相所產(chǎn)生的高壓作用下,形成柱頭的塌陷,被分析的樣品組分的正常色譜峰就變成了雙峰,這時(shí)可按下述方法來修復(fù)色譜柱。首先將柱頭的緊固螺母旋下,這時(shí)就會發(fā)現(xiàn)柱頭內(nèi)的固定相已被壓縮進(jìn)去了,嚴(yán)重時(shí)可縮進(jìn)10mm以上。在這種情況下,我們可用針尖將流動相表層板結(jié)變黃的部分摳掉,并以相同的固定相將此塌陷區(qū)填平、壓實(shí),再將色譜柱的緊固螺絲上緊,修復(fù)工作即告結(jié)束。用經(jīng)過修復(fù)后的色譜柱再做樣品時(shí),色譜峰就恢復(fù)正常了。
 
  以上從幾個(gè)方面簡介了色譜儀的正確使用及故障排除方法。在日常工作中,如果能對這些事項(xiàng)認(rèn)真對待,做到有問題及時(shí)解決,則會大大延長儀器的正常使用期限,并使儀器的性能得到大限度的發(fā)揮。
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